三因子變異數分析 (Three Way ANOVA)

套路24: 三因子變異數分析 (Three Way ANOVA)

應用三因子變異數分析的資料有三影響因子，就是有三個自變項。此檢定有七組H0和HA。
H0: m因子1-1 = m因子1-2 = … = m因子1-m，HA: 至少有一組平均值不同。
H0: m因子2-1 = m因子2-2 = … = m因子2-n，HA: 至少有一組平均值不同。
H0: m因子3-1 = m因子3-2 = … = m因子3-o，HA: 至少有一組平均值不同。
H0: 因子1與因子2互不影響，HA: 因子1與因子2互相影響。
H0: 因子1與因子3互不影響，HA: 因子1與因子3互相影響。
H0: 因子2與因子3互不影響，HA: 因子2與因子3互相影響。
H0: 因子1、因子2與因子3互不影響，HA: 因子1、因子2與因子3互相影響。

1. 使用時機: 變異數分析適用連續資料之差異分析，若自變項有3個，就是三因子變異數分析。
2. 分析類型: 母數分析(parametric analysis)。直接使用資料數值算統計叫parametric方法，把資料排序之後用排序的名次算統計叫non-parametric方法。
3. 假設前提: 每組資料(observations within each cell)都是常態分布(normally distributed)且具相同變異數(equal variances)。
4. 範例資料: 咪路研究溫度對孔雀魚(Poecilia reticulata)、寶蓮燈魚(Paracheirodon axelrodi)及斑馬魚(Danio rerio)生長的影響。在20°C、24°C 及28°C培養下，三種魚身長變化(cm)資料如下：
孔雀魚(Poecilia reticulata)
20°C
24°C
28°C
雄
雌
雄
雌
雄
雌
0.9
0.8
1.15
1.2
1.45
1.5
0.8
0.7
1.05
1.35
1.4
1.55
0.6
0.4
1.0
1.2
1.7
1.5
0.4
0.5
1.0
1.3
1.6
1.35

斑馬魚(Danio rerio)
20°C
24°C
28°C
雄
雌
雄
雌
雄
雌
1.05
1.15
1.2
1.0
1.8
1.55
1.0
1.0
1.3
1.15
1.55
1.5
0.9
0.95
1.35
1.05
1.7
1.4
1.1
0.85
1.15
1.2
1.6
1.6

寶蓮燈魚(Paracheirodon axelrodi)
20°C
24°C
28°C
雄
雌
雄
雌
雄
雌
0.55
0.7
1.0
1.2
1.45
1.6
0.6
0.5
1.05
1.3
1.4
1.45
0.5
0.65
0.95
1.15
1.5
1.4
0.7
0.6
1.1
1.1
1.55
1.45
H0: 三種魚沒差異。 HA: 三種魚有差異。
H0: 溫度沒影響。 HA: 溫度有影響。
H0: 性別沒影響。 HA: 性別有影響。
H0: 魚種及性別沒交互作用。HA: 魚種及性別有交互作用。
H0: 魚種及溫度沒交互作用。 HA: 魚種及溫度有交互作用。
H0: 性別及溫度沒交互作用。 HA: 性別及溫度有交互作用。
H0: 三因子沒交互作用。 HA: 三因子有交互作用。

第一步: 使用基本模組(base)的read.table函數輸入建立資料儲存到變數m。
m <- read.table(header = TRUE, text = "
Fish Temp Sex Growth
F1 t20 M 0.95
F1 t20 M 0.9
F1 t20 M 0.8
F1 t20 M 0.7
F1 t20 F 0.9
F1 t20 F 0.85
F1 t20 F 0.7
F1 t20 F 0.75
F1 t24 M 1.15
F1 t24 M 1.05
F1 t24 M 1
F1 t24 M 1.3
F1 t24 F 1.2
F1 t24 F 1.35
F1 t24 F 1.2
F1 t24 F 1.3
F1 t28 M 1.45
F1 t28 M 1.4
F1 t28 M 1.7
F1 t28 M 1.6
F1 t28 F 1.5
F1 t28 F 1.55
F1 t28 F 1.5
F1 t28 F 1.35
F2 t20 M 1.05
F2 t20 M 1
F2 t20 M 0.9
F2 t20 M 1.1
F2 t20 F 1.15
F2 t20 F 1
F2 t20 F 0.95
F2 t20 F 0.85
F2 t24 M 1.2
F2 t24 M 1.3
F2 t24 M 1.35
F2 t24 M 1.15
F2 t24 F 1
F2 t24 F 1.15
F2 t24 F 1.05
F2 t24 F 1.2
F2 t28 M 1.8
F2 t28 M 1.55
F2 t28 M 1.7
F2 t28 M 1.6
F2 t28 F 1.55
F2 t28 F 1.5
F2 t28 F 1.4
F2 t28 F 1.6
F3 t20 M 0.55
F3 t20 M 0.6
F3 t20 M 0.5
F3 t20 M 0.7
F3 t20 F 0.7
F3 t20 F 0.5
F3 t20 F 0.65
F3 t20 F 0.6
F3 t24 M 1
F3 t24 M 1.05
F3 t24 M 0.95
F3 t24 M 1.1
F3 t24 F 1.2
F3 t24 F 1.3
F3 t24 F 1.15
F3 t24 F 1.1
F3 t28 M 1.45
F3 t28 M 1.4
F3 t28 M 1.5
F3 t28 M 1.55
F3 t28 F 1.6
F3 t28 F 1.45
F3 t28 F 1.4
F3 t28 F 1.45")  # 資料間以空白間隔
attach(m)  # 告知R使用資料m
names(m)  # 指定資料標題

5. 畫圖看資料分佈1:
第一步: 安裝程式套件ggplot2。
第二步: 呼叫ggplot2。
library(ggplot2)
第三步: 使用函數ggplot代入m資料畫box圖。
  ggplot(m, aes(x = Temp, y = Growth, color = Sex)) +
    geom_boxplot() +   # 畫box圖
    facet_grid(. ~ Fish)  # 三種魚畫三格，畫成3 x 1排列
6. 畫圖看資料分佈2:
第一步: 使用基本模組(base)的plot.design函數來畫三個因子的資料分布狀況。
  plot.design(Growth ~ ., data = m)
7. 檢查因子間是否有交互作用(interaction):
第一步: 使用基本模組(base)的interaction.plot函數來畫三個因子交互作用的狀況。
  op <- par(mfrow = c(3, 1))  # 把三個圖畫成3 x 1排列
  interaction.plot(Fish, Temp, Growth)
  interaction.plot(Fish, Sex, Growth)
  interaction.plot(Sex, Temp, Growth)
  op
  par(op)
8. 計算三因子變異數分析:
第一步: 使用基本模組(base)的aov函數代入m中資料來計算三因子變異數分析，結果儲存到變數fm。
  fm <- aov(Growth ~ Fish * Sex * Temp, data = m)
第二步: 使用基本模組(base)的summary函數代入fm來顯示三因子變異數分析結果。
  summary(fm)
                    Df Sum Sq Mean Sq F value   Pr(>F)   
Fish            2  0.454  0.2272  24.475 2.71e-08 ***
Sex            1  0.002  0.0022   0.239   0.6266   
Temp           2  6.164  3.0820 332.024  < 2e-16 ***
Fish:Sex         2  0.093  0.0463   4.986   0.0103 * 
Fish:Temp       4  0.275  0.0689   7.418 7.75e-05 ***
Sex:Temp       2  0.044  0.0219   2.360   0.1041   
Fish:Sex:Temp   4  0.055  0.0138   1.485   0.2196   
Residuals       54  0.501  0.0093                     
---
Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
  # Fish p < 0.05，H0: 三種魚沒差異，不成立。
  # Sex p > 0.05，H0: 性別沒影響，成立。
  # Temp p < 0.05，H0: 溫度沒影響，不成立。
  # Fish:Sex p < 0.05，H0: 魚種及性別沒交互作用，不成立。
  # Fish:Temp p < 0.05，H0: 魚種及溫度沒交互作用，不成立。
  # Sex:Temp p > 0.05，H0: 性別及溫度沒交互作用，成立。
  # Fish:Sex:Temp p > 0.05，H0: 三因子沒交互作用，成立。
第三步: 使用基本模組(base)的TukeyHSD函數代入fm來計算顯示有差異的組別。
  TukeyHSD(fm)
      Tukey multiple comparisons of means
    95% family-wise confidence level
Fit: aov(formula = Growth ~ Fish * Sex * Temp, data = m)
$Fish
          diff         lwr         upr     p adj
F2-F1  0.08125  0.01422237  0.14827763 0.0138460
F3-F1 -0.11250 -0.17952763 -0.04547237 0.0004855
F3-F2 -0.19375 -0.26077763 -0.12672237 0.0000000
$Sex
          diff         lwr       upr     p adj
M-F 0.01111111 -0.03441728 0.0566395 0.6266204
$Temp
             diff       lwr       upr p adj
t24-t20 0.3520833 0.2850557 0.4191110     0
t28-t20 0.7166667 0.6496390 0.7836943     0
t28-t24 0.3645833 0.2975557 0.4316110     0
$`Fish:Sex`
                 diff          lwr          upr     p adj
F2:F-F1:F  0.02083333 -0.095374578  0.137041244 0.9947189
F3:F-F1:F -0.08750000 -0.203707911  0.028707911 0.2437104
F1:M-F1:F -0.01250000 -0.128707911  0.103707911 0.9995430
F2:M-F1:F  0.12916667  0.012958756  0.245374578 0.0210993
F3:M-F1:F -0.15000000 -0.266207911 -0.033792089 0.0045391
F3:F-F2:F -0.10833333 -0.224541244  0.007874578 0.0810467
F1:M-F2:F -0.03333333 -0.149541244  0.082874578 0.9569975
F2:M-F2:F  0.10833333 -0.007874578  0.224541244 0.0810467
F3:M-F2:F -0.17083333 -0.287041244 -0.054625422 0.0008444
F1:M-F3:F  0.07500000 -0.041207911  0.191207911 0.4092852
F2:M-F3:F  0.21666667  0.100458756  0.332874578 0.0000149
F3:M-F3:F -0.06250000 -0.178707911  0.053707911 0.6091849
F2:M-F1:M  0.14166667  0.025458756  0.257874578 0.0085602
F3:M-F1:M -0.13750000 -0.253707911 -0.021292089 0.0116439
F3:M-F2:M -0.27916667 -0.395374578 -0.162958756 0.0000000
$`Fish:Temp`
                  diff         lwr         upr     p adj
F2:t20-F1:t20  0.18125  0.02561637  0.33688363 0.0115001
F3:t20-F1:t20 -0.21875 -0.37438363 -0.06311637 0.0009948
F1:t24-F1:t20  0.37500  0.21936637  0.53063363 0.0000000
F2:t24-F1:t20  0.35625  0.20061637  0.51188363 0.0000000
F3:t24-F1:t20  0.28750  0.13186637  0.44313363 0.0000066
F1:t28-F1:t20  0.68750  0.53186637  0.84313363 0.0000000
F2:t28-F1:t20  0.76875  0.61311637  0.92438363 0.0000000
F3:t28-F1:t20  0.65625  0.50061637  0.81188363 0.0000000
F3:t20-F2:t20 -0.40000 -0.55563363 -0.24436637 0.0000000
F1:t24-F2:t20  0.19375  0.03811637  0.34938363 0.0052581
F2:t24-F2:t20  0.17500  0.01936637  0.33063363 0.0167564
F3:t24-F2:t20  0.10625 -0.04938363  0.26188363 0.4168940
F1:t28-F2:t20  0.50625  0.35061637  0.66188363 0.0000000
F2:t28-F2:t20  0.58750  0.43186637  0.74313363 0.0000000
F3:t28-F2:t20  0.47500  0.31936637  0.63063363 0.0000000
F1:t24-F3:t20  0.59375  0.43811637  0.74938363 0.0000000
F2:t24-F3:t20  0.57500  0.41936637  0.73063363 0.0000000
F3:t24-F3:t20  0.50625  0.35061637  0.66188363 0.0000000
F1:t28-F3:t20  0.90625  0.75061637  1.06188363 0.0000000
F2:t28-F3:t20  0.98750  0.83186637  1.14313363 0.0000000
F3:t28-F3:t20  0.87500  0.71936637  1.03063363 0.0000000
F2:t24-F1:t24 -0.01875 -0.17438363  0.13688363 0.9999826
F3:t24-F1:t24 -0.08750 -0.24313363  0.06813363 0.6713875
F1:t28-F1:t24  0.31250  0.15686637  0.46813363 0.0000010
F2:t28-F1:t24  0.39375  0.23811637  0.54938363 0.0000000
F3:t28-F1:t24  0.28125  0.12561637  0.43688363 0.0000106
F3:t24-F2:t24 -0.06875 -0.22438363  0.08688363 0.8822624
F1:t28-F2:t24  0.33125  0.17561637  0.48688363 0.0000002
F2:t28-F2:t24  0.41250  0.25686637  0.56813363 0.0000000
F3:t28-F2:t24  0.30000  0.14436637  0.45563363 0.0000025
F1:t28-F3:t24  0.40000  0.24436637  0.55563363 0.0000000
F2:t28-F3:t24  0.48125  0.32561637  0.63688363 0.0000000
F3:t28-F3:t24  0.36875  0.21311637  0.52438363 0.0000000
F2:t28-F1:t28  0.08125 -0.07438363  0.23688363 0.7517336
F3:t28-F1:t28 -0.03125 -0.18688363  0.12438363 0.9991866
F3:t28-F2:t28 -0.11250 -0.26813363  0.04313363 0.3401715
$`Sex:Temp`
                   diff         lwr        upr     p adj
M:t20-F:t20  0.01250000 -0.10370791 0.12870791 0.9995430
F:t24-F:t20  0.38333333  0.26712542 0.49954124 0.0000000
M:t24-F:t20  0.33333333  0.21712542 0.44954124 0.0000000
F:t28-F:t20  0.68750000  0.57129209 0.80370791 0.0000000
M:t28-F:t20  0.75833333  0.64212542 0.87454124 0.0000000
F:t24-M:t20  0.37083333  0.25462542 0.48704124 0.0000000
M:t24-M:t20  0.32083333  0.20462542 0.43704124 0.0000000
F:t28-M:t20  0.67500000  0.55879209 0.79120791 0.0000000
M:t28-M:t20  0.74583333  0.62962542 0.86204124 0.0000000
M:t24-F:t24 -0.05000000 -0.16620791 0.06620791 0.7991187
F:t28-F:t24  0.30416667  0.18795876 0.42037458 0.0000000
M:t28-F:t24  0.37500000  0.25879209 0.49120791 0.0000000
F:t28-M:t24  0.35416667  0.23795876 0.47037458 0.0000000
M:t28-M:t24  0.42500000  0.30879209 0.54120791 0.0000000
M:t28-F:t28  0.07083333 -0.04537458 0.18704124 0.4738269
$`Fish:Sex:Temp`
                           diff           lwr           upr     p adj
F2:F:t20-F1:F:t20  1.875000e-01 -0.0619875165  0.4369875165 0.3718795
F3:F:t20-F1:F:t20 -1.875000e-01 -0.4369875165  0.0619875165 0.3718795
F1:M:t20-F1:F:t20  3.750000e-02 -0.2119875165  0.2869875165 1.0000000
F2:M:t20-F1:F:t20  2.125000e-01 -0.0369875165  0.4619875165 0.1850236
F3:M:t20-F1:F:t20 -2.125000e-01 -0.4619875165  0.0369875165 0.1850236
F1:F:t24-F1:F:t20  4.625000e-01  0.2130124835  0.7119875165 0.0000013
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F3:F:t24-F1:F:t20  3.875000e-01  0.1380124835  0.6369875165 0.0000729
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F1:M:t28-F1:M:t24  4.125000e-01  0.1630124835  0.6619875165 0.0000194
F2:M:t28-F1:M:t24  5.375000e-01  0.2880124835  0.7869875165 0.0000000
F3:M:t28-F1:M:t24  3.500000e-01  0.1005124835  0.5994875165 0.0005041
F3:M:t24-F2:M:t24 -2.250000e-01 -0.4744875165  0.0244875165 0.1228877
F1:F:t28-F2:M:t24  2.250000e-01 -0.0244875165  0.4744875165 0.1228877
F2:F:t28-F2:M:t24  2.625000e-01  0.0130124835  0.5119875165 0.0296357
F3:F:t28-F2:M:t24  2.250000e-01 -0.0244875165  0.4744875165 0.1228877
F1:M:t28-F2:M:t24  2.875000e-01  0.0380124835  0.5369875165 0.0100923
F2:M:t28-F2:M:t24  4.125000e-01  0.1630124835  0.6619875165 0.0000194
F3:M:t28-F2:M:t24  2.250000e-01 -0.0244875165  0.4744875165 0.1228877
F1:F:t28-F3:M:t24  4.500000e-01  0.2005124835  0.6994875165 0.0000026
F2:F:t28-F3:M:t24  4.875000e-01  0.2380124835  0.7369875165 0.0000003
F3:F:t28-F3:M:t24  4.500000e-01  0.2005124835  0.6994875165 0.0000026
F1:M:t28-F3:M:t24  5.125000e-01  0.2630124835  0.7619875165 0.0000001
F2:M:t28-F3:M:t24  6.375000e-01  0.3880124835  0.8869875165 0.0000000
F3:M:t28-F3:M:t24  4.500000e-01  0.2005124835  0.6994875165 0.0000026
F2:F:t28-F1:F:t28  3.750000e-02 -0.2119875165  0.2869875165 1.0000000
F3:F:t28-F1:F:t28  4.440892e-16 -0.2494875165  0.2494875165 1.0000000
F1:M:t28-F1:F:t28  6.250000e-02 -0.1869875165  0.3119875165 0.9999669
F2:M:t28-F1:F:t28  1.875000e-01 -0.0619875165  0.4369875165 0.3718795
F3:M:t28-F1:F:t28  4.440892e-16 -0.2494875165  0.2494875165 1.0000000
F3:F:t28-F2:F:t28 -3.750000e-02 -0.2869875165  0.2119875165 1.0000000
F1:M:t28-F2:F:t28  2.500000e-02 -0.2244875165  0.2744875165 1.0000000
F2:M:t28-F2:F:t28  1.500000e-01 -0.0994875165  0.3994875165 0.7437223
F3:M:t28-F2:F:t28 -3.750000e-02 -0.2869875165  0.2119875165 1.0000000
F1:M:t28-F3:F:t28  6.250000e-02 -0.1869875165  0.3119875165 0.9999669
F2:M:t28-F3:F:t28  1.875000e-01 -0.0619875165  0.4369875165 0.3718795
F3:M:t28-F3:F:t28  0.000000e+00 -0.2494875165  0.2494875165 1.0000000
F2:M:t28-F1:M:t28  1.250000e-01 -0.1244875165  0.3744875165 0.9223869
F3:M:t28-F1:M:t28 -6.250000e-02 -0.3119875165  0.1869875165 0.9999669
F3:M:t28-F2:M:t28 -1.875000e-01 -0.4369875165  0.0619875165 0.3718795
   
9. 檢查不同組別數值是否符合相同變異數假設前提(Check the homogeneity of variance assumption)。
第一步: 安裝car程式套件。
第二步: 呼叫car程式套件備用。
  library(car)
第三步: 閱讀car程式套件leveneTest函數使用說明。
  help(leveneTest)
第四步: 使用leveneTest函數檢查不同組別數值是否符合相同變異數。
  leveneTest(Growth ~ Fish * Sex * Temp, data = m)
Levene's Test for Homogeneity of Variance (center = median)
          Df F value Pr(>F)
group 17  0.5445 0.9163   # p > 0.05不同組別數值符合相同變異數。
          54
  # p < 0.05不同組別數值不符合相同變異數。
  # p > 0.05不同組別數值符合相同變異數。

10. 檢查不同組別數值是否符合常態分布假設前提(Check the normality assumption)。
第一步: 使用基本模組(base)的residuals函數代入fm來顯示三因子分析的殘差結果存入變數aov_residuals。
  aov_residuals <- residuals(object = fm)
第二步: 使用基本模組(base)的shapiro.test函數代入aov_residuals來檢查不同組別數值是否符合常態分布。
  shapiro.test(x = aov_residuals)
        Shapiro-Wilk normality test
data:  aov_residuals
W = 0.96553, p-value = 0.04566   # p < 0.05不同組別數值不符合常態分布。
  # p < 0.05不同組別數值不符合常態分布。
  # p > 0.05不同組別數值符合常態分布。

來勁了嗎? 想知道更多?? 補充資料(連結):
1. F-test (https://en.wikipedia.org/wiki/F-test)
2. Analysis of variance (https://en.wikipedia.org/wiki/Analysis_of_variance)
3. Three way ANOVA (https://www.r-bloggers.com/raccoon-ch-2-4-3-way-anova/)
4. 關於R基礎，R繪圖及統計快速入門:
   a. R Tutorial: https://www.tutorialspoint.com/r/index.htm
   b. Cookbook for R: http://www.cookbook-r.com/
   c. Quick-R: https://www.statmethods.net/
   d. Statistical tools for high-throughput data analysis (STHDA): http://www.sthda.com/english/
e. The Handbook of Biological Statistics: http://www.biostathandbook.com/
f. An R Companion for the Handbook of Biological Statistics: http://rcompanion.org/rcompanion/index.html
5. Zar, JH. 2010. Biostatistical Analysis, Fifth Edition, Pearson.

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